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Nature重磅!CRISPR–Cas9 篩選揭示神經(jīng)干細(xì)胞衰老調(diào)控因子

更新時間:2024-10-23      點擊次數(shù):1341

各位讀者好,今天解讀的文章是10月最新發(fā)表在《Nature》(Q1,IF69.5)上的,題為‘CRISPR–Cas9 screens reveal regulators of ageing in neural stem cells’,中文譯名:CRISPR–Cas9 篩選揭示神經(jīng)干細(xì)胞衰老調(diào)控因子。?


我們知道神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)是大腦中的一類重要細(xì)胞,它們在成年期負(fù)責(zé)新神經(jīng)元的生成和腦損傷后的組織修復(fù)。然而,隨著年齡的增長,NSCs的功能會逐漸下降,導(dǎo)致新神經(jīng)元產(chǎn)生減少和損傷后再生能力下降。


盡管過去已有研究通過遺傳干預(yù)改善了老年大腦的功能,但對老年NSCs的系統(tǒng)性功能測試尚未進(jìn)行。因此,本篇文章旨在通過開發(fā)體外和體內(nèi)高通量CRISPR–Cas9篩選平臺,系統(tǒng)地鑒定能夠促進(jìn)老年小鼠NSCs激活的基因敲除,這些研究不僅為理解老年NSCs的功能衰退提供了新的分子機(jī)制,也為開發(fā)抗衰老干預(yù)措施提供了潛在的靶點和新措施



實驗方法與目的


研究人員首先在體外建立了基于CRISPR–Cas9的基因敲除篩選平臺,通過在年輕和老年小鼠的NSCs原代培養(yǎng)中進(jìn)行全基因組篩選,鑒定出能夠特異性恢復(fù)老年NSCs激活的基因敲除。接著,研究人員在體內(nèi)建立CRISPR–Cas9篩選平臺,通過在老年小鼠大腦中進(jìn)行基因敲除,鑒定出能夠促進(jìn)NSCs激活和新神經(jīng)元產(chǎn)生的基因。


體外篩選平臺的建立


1. sgRNA的設(shè)計:研究人員首先根據(jù)目標(biāo)基因序列設(shè)計特定的單鏈引導(dǎo)RNA(sgRNA)。

2. 構(gòu)建編輯載體:將設(shè)計好的sgRNA序列克隆到表達(dá)Cas9蛋白的質(zhì)粒或病毒載體中。

3. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:將構(gòu)建好的CRISPR–Cas9載體導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞,如神經(jīng)干細(xì)胞。

4. 篩選和驗證:通過抗生素篩選、PCR和測序等分子生物學(xué)方法,篩選獲得基因編輯效果的細(xì)胞,并驗證基因敲除效果。

5.功能分析:研究敲除基因后細(xì)胞的表型變化和功能影響,如細(xì)胞增殖、分化、遷移等。


體內(nèi)篩選平臺的建立


1.立體定位腦內(nèi)注射:研究人員通過立體定位手術(shù)將攜帶sgRNA的慢病毒直接注入老年Cas9小鼠的側(cè)腦室,靠近神經(jīng)干細(xì)胞的微環(huán)境(SVZ)。

2.基因敲除效果的驗證:幾周后,收集小鼠的嗅球(OB),通過基因組測序分析sgRNA的富集情況,以評估基因敲除的效果。

3.免疫熒光成像:對注射后的腦組織進(jìn)行免疫熒光染色,以驗證基因敲除對神經(jīng)干細(xì)胞激活和神經(jīng)發(fā)生的影響。

4. 基因敲除效率的評估:通過流式細(xì)胞術(shù)(FACS)和Western Blot等技術(shù),評估基因敲除的效率和特異性。


這些平臺的建立為研究人員提供了強(qiáng)大的工具,以系統(tǒng)地研究老年神經(jīng)干細(xì)胞的衰老機(jī)制,并為開發(fā)抗衰老干預(yù)措施提供了新的策略。通過這些技術(shù),研究人員能夠精確地敲除特定的基因,并評估這些基因敲除對細(xì)胞功能的影響,從而揭示調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞衰老的關(guān)鍵分子途徑。


結(jié)果分析


體外篩選平臺的建立與基因靶點鑒定


研究人員通過體外篩選平臺,對年輕和老年NSCs進(jìn)行了全基因組CRISPR–Cas9篩選。通過高通量篩選,研究者發(fā)現(xiàn)了300多個基因靶點,這些靶點敲除能夠特異性地恢復(fù)老年NSCs的激活(圖1a-c)。這些基因靶點主要涉及纖毛組織和葡萄糖攝取過程,提示這些生物學(xué)過程可能在NSCs的衰老中發(fā)揮重要作用。


圖片


體內(nèi)篩選平臺的建立與基因敲除的鑒定


為了驗證體外篩選結(jié)果的體內(nèi)效應(yīng),研究者還建立了一個體內(nèi)CRISPR–Cas9篩選平臺。通過在老年小鼠大腦中進(jìn)行基因敲除,研究者鑒定出24個基因靶點,這些靶點能夠促進(jìn)NSCs的激活和新神經(jīng)元的產(chǎn)生(圖2a-d)。這些結(jié)果表明,通過CRISPR–Cas9技術(shù)在體內(nèi)進(jìn)行基因敲除是一種有效的策略,可以用于研究老年NSCs的功能衰退。


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Slc2a4基因敲除對老年NSCs功能的影響


在所有鑒定出的基因敲除的靶點中,Slc2a4基因(編碼GLUT4葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)的敲除是提高老年NSCs功能的zui有效干預(yù)措施之一(圖3a-d)。研究者發(fā)現(xiàn),隨著年齡的增長,NSCs中的葡萄糖攝取增加,而短暫的葡萄糖饑餓可以恢復(fù)老年NSCs的激活能力。因此,葡萄糖攝取的增加,可能會加速隨年齡增長而導(dǎo)致的NSCs激活能力的下降。


圖片


老年NSCs的高葡萄糖攝取及其對NSC激活的影響


研究者進(jìn)一步分析了老年NSCs的葡萄糖攝取特性。通過體外實驗,研究者發(fā)現(xiàn)老年qNSCs和aNSCs的葡萄糖攝取是年輕對照組的兩倍(圖4a-f),說明通過遺傳或通過葡萄糖限制來逆轉(zhuǎn)這種增加,可以促進(jìn)老年NSCs的激活。這些結(jié)果表明,老年qNSCs處于高葡萄糖攝取狀態(tài),這可能是由于隨著年齡的增長GLUT4表達(dá)的增加。然而,這種狀態(tài)可以通過遺傳或葡萄糖限制干預(yù)來逆轉(zhuǎn),以促進(jìn)老年qNSCs的激活。


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文章結(jié)果


本研究中,我們利用CRISPR-Cas9篩選平臺成功鑒定了300多個能夠促進(jìn)老年神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)激活的基因靶點,其中Slc2a4基因的敲除是提高老年NSCs功能的zui有效干預(yù)措施之一。此外,研究還發(fā)現(xiàn)老年NSCs表現(xiàn)出高葡萄糖攝取,這一特性可以通過遺傳或葡萄糖限制干預(yù)來逆轉(zhuǎn),進(jìn)而促進(jìn)老年NSCs的激活。這些發(fā)現(xiàn)為老年NSCs的功能衰退的研究提供了新的見解,并為開發(fā)抗衰老干預(yù)藥物提供了潛在靶點。




未來研究方向




本文通過CRISPR-Cas9篩選平臺揭示了老年神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)中葡萄糖代謝的變化,特別是GLUT4(Slc2a4)在老年NSCs中的作用。結(jié)合這一發(fā)現(xiàn)及近年來國家自然科學(xué)基金熱點相關(guān)領(lǐng)域,未來可以繼續(xù)探索GLUT4相關(guān)的信號通路(如胰島素/IGF信號通路)在NSCs衰老中的作用,以及這些信號通路如何影響衰老相關(guān)的變化,或是開發(fā)新的基因編輯工具和技術(shù),以更精確地研究和調(diào)控NSCs的代謝狀態(tài)和功能。

此外,還可以探索其他干細(xì)胞類型(如造血干細(xì)胞和肌肉干細(xì)胞)中是否也存在類似的代謝變化,并研究這些變化是否對細(xì)胞功能有類似的影響。或可通過探索GLUT4敲除或葡萄糖限制干預(yù)是否能夠在其他組織或器官中促進(jìn)細(xì)胞的再生和修復(fù),發(fā)現(xiàn)延緩衰老過程的機(jī)制。



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