各位讀者好，今天解讀的文章是10月最新發(fā)表在《Nature》（Q1，IF69.5）上的，題為‘CRISPR–Cas9 screens reveal regulators of ageing in neural stem cells’，中文譯名：CRISPR–Cas9 篩選揭示神經(jīng)干細(xì)胞衰老調(diào)控因子。?

我們知道神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）是大腦中的一類重要細(xì)胞，它們在成年期負(fù)責(zé)新神經(jīng)元的生成和腦損傷后的組織修復(fù)。然而，隨著年齡的增長，NSCs的功能會逐漸下降，導(dǎo)致新神經(jīng)元產(chǎn)生減少和損傷后再生能力下降。

盡管過去已有研究通過遺傳干預(yù)改善了老年大腦的功能，但對老年NSCs的系統(tǒng)性功能測試尚未進(jìn)行。因此，本篇文章旨在通過開發(fā)體外和體內(nèi)高通量CRISPR–Cas9篩選平臺，系統(tǒng)地鑒定能夠促進(jìn)老年小鼠NSCs激活的基因敲除，這些研究不僅為理解老年NSCs的功能衰退提供了新的分子機(jī)制，也為開發(fā)抗衰老干預(yù)措施提供了潛在的靶點和新措施

研究人員首先在體外建立了基于CRISPR–Cas9的基因敲除篩選平臺，通過在年輕和老年小鼠的NSCs原代培養(yǎng)中進(jìn)行全基因組篩選，鑒定出能夠特異性恢復(fù)老年NSCs激活的基因敲除。接著，研究人員在體內(nèi)建立CRISPR–Cas9篩選平臺，通過在老年小鼠大腦中進(jìn)行基因敲除，鑒定出能夠促進(jìn)NSCs激活和新神經(jīng)元產(chǎn)生的基因。

體外篩選平臺的建立

1. sgRNA的設(shè)計：研究人員首先根據(jù)目標(biāo)基因序列設(shè)計特定的單鏈引導(dǎo)RNA（sgRNA）。

2. 構(gòu)建編輯載體：將設(shè)計好的sgRNA序列克隆到表達(dá)Cas9蛋白的質(zhì)粒或病毒載體中。

3. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將構(gòu)建好的CRISPR–Cas9載體導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞，如神經(jīng)干細(xì)胞。

4. 篩選和驗證：通過抗生素篩選、PCR和測序等分子生物學(xué)方法，篩選獲得基因編輯效果的細(xì)胞，并驗證基因敲除效果。

5.功能分析：研究敲除基因后細(xì)胞的表型變化和功能影響，如細(xì)胞增殖、分化、遷移等。

體內(nèi)篩選平臺的建立

1.立體定位腦內(nèi)注射：研究人員通過立體定位手術(shù)將攜帶sgRNA的慢病毒直接注入老年Cas9小鼠的側(cè)腦室，靠近神經(jīng)干細(xì)胞的微環(huán)境（SVZ）。

2.基因敲除效果的驗證：幾周后，收集小鼠的嗅球（OB），通過基因組測序分析sgRNA的富集情況，以評估基因敲除的效果。

3.免疫熒光成像：對注射后的腦組織進(jìn)行免疫熒光染色，以驗證基因敲除對神經(jīng)干細(xì)胞激活和神經(jīng)發(fā)生的影響。

4. 基因敲除效率的評估：通過流式細(xì)胞術(shù)（FACS）和Western Blot等技術(shù)，評估基因敲除的效率和特異性。

這些平臺的建立為研究人員提供了強(qiáng)大的工具，以系統(tǒng)地研究老年神經(jīng)干細(xì)胞的衰老機(jī)制，并為開發(fā)抗衰老干預(yù)措施提供了新的策略。通過這些技術(shù)，研究人員能夠精確地敲除特定的基因，并評估這些基因敲除對細(xì)胞功能的影響，從而揭示調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞衰老的關(guān)鍵分子途徑。

體外篩選平臺的建立與基因靶點鑒定

研究人員通過體外篩選平臺，對年輕和老年NSCs進(jìn)行了全基因組CRISPR–Cas9篩選。通過高通量篩選，研究者發(fā)現(xiàn)了300多個基因靶點，這些靶點敲除能夠特異性地恢復(fù)老年NSCs的激活（圖1a-c）。這些基因靶點主要涉及纖毛組織和葡萄糖攝取過程，提示這些生物學(xué)過程可能在NSCs的衰老中發(fā)揮重要作用。

體內(nèi)篩選平臺的建立與基因敲除的鑒定

為了驗證體外篩選結(jié)果的體內(nèi)效應(yīng)，研究者還建立了一個體內(nèi)CRISPR–Cas9篩選平臺。通過在老年小鼠大腦中進(jìn)行基因敲除，研究者鑒定出24個基因靶點，這些靶點能夠促進(jìn)NSCs的激活和新神經(jīng)元的產(chǎn)生（圖2a-d）。這些結(jié)果表明，通過CRISPR–Cas9技術(shù)在體內(nèi)進(jìn)行基因敲除是一種有效的策略，可以用于研究老年NSCs的功能衰退。

Slc2a4基因敲除對老年NSCs功能的影響

在所有鑒定出的基因敲除的靶點中，Slc2a4基因（編碼GLUT4葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）的敲除是提高老年NSCs功能的zui有效干預(yù)措施之一（圖3a-d）。研究者發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長，NSCs中的葡萄糖攝取增加，而短暫的葡萄糖饑餓可以恢復(fù)老年NSCs的激活能力。因此，葡萄糖攝取的增加，可能會加速隨年齡增長而導(dǎo)致的NSCs激活能力的下降。

老年NSCs的高葡萄糖攝取及其對NSC激活的影響

研究者進(jìn)一步分析了老年NSCs的葡萄糖攝取特性。通過體外實驗，研究者發(fā)現(xiàn)老年qNSCs和aNSCs的葡萄糖攝取是年輕對照組的兩倍（圖4a-f），說明通過遺傳或通過葡萄糖限制來逆轉(zhuǎn)這種增加，可以促進(jìn)老年NSCs的激活。這些結(jié)果表明，老年qNSCs處于高葡萄糖攝取狀態(tài)，這可能是由于隨著年齡的增長GLUT4表達(dá)的增加。然而，這種狀態(tài)可以通過遺傳或葡萄糖限制干預(yù)來逆轉(zhuǎn)，以促進(jìn)老年qNSCs的激活。